Molekularna

  • Zwiększ rozmiar czcionki
  • Domyślny  rozmiar czcionki
  • Zmniejsz rozmiar czcionki

Sekwencjonowanie z wykorzystaniem BIG-DYE

Email Drukuj

1. PCR

W pierwszym kroku należy namnożyć fragment przeznaczony do sekwencjonowania. Następnie oczyścić produkt z wolnych oligonukleotydów oraz wolnych dNTPs. W tym celu można się posłużyć dwiema metodami:

  • trawienie enzymami - zalecany jest PCR CleanUp Mix firmy GeneSys (www.gene-sys.pl) - 1ul MIX'a na 5 ul PCR'a; inkubacja 37oC przez 15-30 minut (czas należy dobrać eksperymentalnie), potem 80oC przez 15 min.
  • metodą kolumienkową - zalecany zestaw PCR Purification Kit firmy GeneSys (www.gene-sys.pl)

Po oczyszczeniu produktu należy zmierzyć stężenie DNA.

2. Sekwencjonowanie

Należy przygotować mieszaninę reakcyjną zawierającą:

DNA matrycowe (0.1-1.0 ug) X ul
Primer reakcji (3.2 pmol) X ul
Big Dye 
2 ul
2.5X BD buffer
2 ul
H2O uzupełnić do 20 ul

Warunki reakcji:

denaturacja 96oC przez 1 min
35 cykli
96oC przez 10 sek
50oC przez 5 sek
60oC przez 4 min
4oC do czasu wyjęcia próbek z termocyklera

 

 

3a. Precypitacja produktu po sekwencjonowaniu

  1. Przygotowanie mieszaniny precypitacyjnej (każda w osobnej probówce 1.5 ml):
      • 2 ul  3M NaOAC
      • 50 ul 95% EtOH
  2. Do takiej mieszaniny dodać produkt po sekwencjonowaniu.
  3. Umieścić na lodzie na 10 min (nie dłużej aż zobaczymy wyprecypitowany kolorowy osad).
  4. Odwirować na maksymalnej prędkości (czyli ok 10 000 - 15 000 g) przez 15-30 min.
  5. Osad przemyć 70% EtOH.
  6. Po zlaniu etanolu podsuszyć osad przez 10-15 minut (bez grzania). UWAGA nie wolno przesuszyć.
  7. Osad rozpuścić w formamidzie lub przechowywać w postaci nierozpuszczonej w -20oC.

3b. Oczyszczanie produktu po sekwencjonowaniu.

Jest to metoda alternatywna do precypitacji. Można ją używać dla produktów do 500bp.

 

  1. Do 5ul produktu po sekwencjonowaniu dodać 1ul enzymu SAP (alkaliczna fosfataza).
  2. Inkubować przez 1h w temperaturze 37oC, a następnie 20 min w temperaturze 70oC.
  3. Do rozdziału na sekwenator sporządzić mieszaninę: 1-3ul mieszaniny po trawieniu + 9ul formamidu.

 

4. Rozdział produktów sekwencjonowania

Zalecany jest rozdział produktów wg dołączonego do zestawu manuala.

 

UWAGI:

  1. Trzeba pamiętać że zarówno etanol jak i wysokie stężenie soli wpływa na wydajność reakcji sekwencjonowania.
  2. Produkt sekwencjonowania nie powinien być przechowywany w formamidzie. Jeśli nie planujemy rozdziału bezpośrednio po precypitacji bezpieczniej jest przechowywać produkt w postaci osadu w -20oC.

Powyższa procedura została wypróbowana przez autora niniejszego opracowania jednak nie bierze on odpowiedzialności za jej wykorzystanie.

 

stat


Sprzęt

Reklama