1. PCR
W pierwszym kroku należy namnożyć fragment przeznaczony do sekwencjonowania. Następnie oczyścić produkt z wolnych oligonukleotydów oraz wolnych dNTPs. W tym celu można się posłużyć dwiema metodami:
- trawienie enzymami - zalecany jest PCR CleanUp Mix firmy GeneSys (www.gene-sys.pl) - 1ul MIX'a na 5 ul PCR'a; inkubacja 37oC przez 15-30 minut (czas należy dobrać eksperymentalnie), potem 80oC przez 15 min.
- metodą kolumienkową - zalecany zestaw PCR Purification Kit firmy GeneSys (www.gene-sys.pl)
Po oczyszczeniu produktu należy zmierzyć stężenie DNA.
2. Sekwencjonowanie
Należy przygotować mieszaninę reakcyjną zawierającą:
| DNA matrycowe (0.1-1.0 ug) | X ul |
| Primer reakcji (3.2 pmol) | X ul |
| Big Dye |
2 ul |
| 2.5X BD buffer |
2 ul |
| H2O | uzupełnić do 20 ul |
Warunki reakcji:
| denaturacja 96oC przez 1 min | |
| 35 cykli | |
| 96oC przez 10 sek | |
| 50oC przez 5 sek | |
| 60oC przez 4 min | |
| 4oC do czasu wyjęcia próbek z termocyklera |
3a. Precypitacja produktu po sekwencjonowaniu
- Przygotowanie mieszaniny precypitacyjnej (każda w osobnej probówce 1.5 ml):
-
- 2 ul 3M NaOAC
- 50 ul 95% EtOH
-
- Do takiej mieszaniny dodać produkt po sekwencjonowaniu.
- Umieścić na lodzie na 10 min (nie dłużej aż zobaczymy wyprecypitowany kolorowy osad).
- Odwirować na maksymalnej prędkości (czyli ok 10 000 - 15 000 g) przez 15-30 min.
- Osad przemyć 70% EtOH.
- Po zlaniu etanolu podsuszyć osad przez 10-15 minut (bez grzania). UWAGA nie wolno przesuszyć.
- Osad rozpuścić w formamidzie lub przechowywać w postaci nierozpuszczonej w -20oC.
3b. Oczyszczanie produktu po sekwencjonowaniu.
Jest to metoda alternatywna do precypitacji. Można ją używać dla produktów do 500bp.
- Do 5ul produktu po sekwencjonowaniu dodać 1ul enzymu SAP (alkaliczna fosfataza).
- Inkubować przez 1h w temperaturze 37oC, a następnie 20 min w temperaturze 70oC.
- Do rozdziału na sekwenator sporządzić mieszaninę: 1-3ul mieszaniny po trawieniu + 9ul formamidu.
4. Rozdział produktów sekwencjonowania
Zalecany jest rozdział produktów wg dołączonego do zestawu manuala.
UWAGI:
- Trzeba pamiętać że zarówno etanol jak i wysokie stężenie soli wpływa na wydajność reakcji sekwencjonowania.
- Produkt sekwencjonowania nie powinien być przechowywany w formamidzie. Jeśli nie planujemy rozdziału bezpośrednio po precypitacji bezpieczniej jest przechowywać produkt w postaci osadu w -20oC.
Powyższa procedura została wypróbowana przez autora niniejszego opracowania jednak nie bierze on odpowiedzialności za jej wykorzystanie.
