Molekularna

  • Zwiększ rozmiar czcionki
  • Domyślny  rozmiar czcionki
  • Zmniejsz rozmiar czcionki

Minisekwencjonowanie

Email Drukuj

 

1. PCR

W pierwszym kroku należy namnożyć fragment przeznaczony do sekwencjonowania. Następnie oczyścić produkt z wolnych oligonukleotydów oraz wolnych dNTPs. W tym celu można się posłużyć dwiema metodami:

  • trawienie enzymami - zalecany jest PCR CleanUp Mix firmy GeneSys (www.gene-sys.pl) - 1ul MIX'a na 1.5 ul PCR'a; inkubacja 37oC przez 15-30 minut (czas należy dobrać eksperymentalnie), potem 80oC przez 15 min.
  • metodą kolumienkową - zalecany zestaw PCR Purification Kit firmy GeneSys (www.gene-sys.pl)

2. Minisekwencjonowanie

Do tej reakcji polecany jest zestaw firmy Applied Biosystsems (obecnie Life Technologies) SNaPshot Multiplex Kit.

Należy sporządzić mieszaninę:

  • DNA MIX po oczyszczaniu ( z poprzedniego kroku)    2.5 ul
  • SNaPshot MIX                                                     2.5 ul
  • mieszanina primerów  (o stężenie 1 pmol/ul)            0.5 ul

Warunki reakcji:

25 cykli po:

96oC  przez 10 sek

50oC  przez  5 sek

60oC  przez 30 sek

4oC po reakcji do wyjęcia próbek z termocyklera

Po zakończonej reakcji należy oczyścić mieszaninę z niezwiązanych dideoksynukleotydów. Zalecane jest dodanie 1ul SAP oraz inkubacja 37oC przez 1h, potem 70oC przez 15 min.

Warunki rozdziału:

Czas iniekcji (Injection time):           5-10 sek

Napięcie (Electrophoresis voltage):   15 kV

Czas rozdziału:                               15 min

Temperatura (Heat plate temperature)  60oC

Moduł:                                         GS POP-4 (1ml) E5

Filtr:                                             E5

Powyższa procedura została wypróbowana przez autora niniejszego opracowania jednak nie bierze on odpowiedzialności za jej wykorzystanie.

 

stat


Sprzęt

Reklama