Molekularna

  • Zwiększ rozmiar czcionki
  • Domyślny  rozmiar czcionki
  • Zmniejsz rozmiar czcionki

Izolacja DNA z krwi obwodowej

Email Drukuj

Procedura izolacji DNA z krwi obwodowej (pobranej na EDTA, heparynę lub cytrynian) metodą fenolową.

BUFORY:

1. Bufor lizujący

H4Cl 8.29g  (końc. stęż. 155mM)
KHCO3
1g (końc. stęż. 10mM)
EDTA

0.034g lub 200 ul 0.5M EDTA

(końc. stęż. 0.1mM)

Całość rozpuścić w 800 ml wody destylowanej
Doprowadzić do pH 7.4 używając 1M HCl lub 1M NaOH
Dolać wody destylowanej do objętości 1L

 

2. Chloroform/ alkohol izoamylowy 24:1

Chloroform              24ml

Alkohol izoamylowy    1ml

2. Bufor SE

NaCl 4.39g (końc. stęż. 75mM)
EDTA

8.41 g lub 50 ml 0.5M EDTA

(końc. stęż. 25mM)

Całość rozpuścić w 800 ml wody destylowanej
Doprowadzić do pH 8.0 używając  1M NaOH
Dolać wody destylowanej do objętości 1L

 

3. Octan sodu

3M octan sodu
246g (końc. stęż. 3M)
Całość rozpuścić w 500 ml wody destylowanej
Doprowadzić do pH 5.2 używając stężonego CH3COOH
Dolać wody destylowanej do objętości 1L

4. Proteinaza K

Rozpuścić 10mg proteinazy K w 10ml buforu TE. Mieszać ostrożnie przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Przechowywać w postaci rozpuszczonej w -20oC.

 

PROCEDURA

1. Odmierzyć 10 ml krwi pobranej na EDTA lub heparynę lub cytrynian. Dodać 30 ml buforu lizującego. Dokładnie wymieszać oraz inkubować 30-60 min na lodzie.

2. Wirować 1200rpm przez 10 minut w 4oC.

3. Usunąć supernatant. Osad rozpuścić w 10ml buforu lizującego.

4. Wirować 1200rpm przez 10 minut w 4oC.

5. Usunąć supernatant. Osad rozpuścić w 5ml buforu SE.

6. Wirować 1200rpm przez 10 minut w 4oC.

7. Usunąć supernatant. Osad rozpuścić w 5ml buforu SE. Dodać 40ul proteinazy K (10mg/ml) oraz 250ul 20% SDS. Dokładnie wymieszać. Inkubować przez całą noc w 37oC.

8. Dodać mieszaninę 5ml buforu SE oraz 10ml fenolu. Mieszać ręcznie przez 10 minut.

9. Wirować 3000rpm przez 5 minut w 10oC.

10. Supernatant przenieść do nowej probówki. Dodać 10ml mieszaniny fenol/chloroform/alkohol izoamylowy w stosunku 25:24:1. Mieszać ręcznie przez 10 minut.

11. Wirować 3000rpm przez 5 minut w 10oC.

12. Przenieść supernatant do nowej probówki. Dodać 10ml mieszaniny chloroform/alkohol izoamylowy (24:1). Mieszać ręcznie przez 10 minut.

13. Wirować 3000rpm przez 5 minut w 10oC.

14. Supernatant przenieść do nowej probówki. Dodać 300ul 3M octanu sodu oraz 10 ml izopropanolu. Mieszać energicznie szklaną bagietką aż do precypitacji DNA (w postaci białych kłaczków). Wyprecypitowane DNA przenieść za pomocą szklanej bagietki do nowej probówki.

15. Przemyć DNA 70% etanolem.

16. DNA rozpuścić 0.5-1ml buforu TE (mieszać co najmniej przez noc w 4oC, jeśli DNA się nie rozpuściło przedłużyć mieszanie aż do rozpuszczenia).

17. Stężenie DNA zmierzyć spektrofotometrycznie (260/280).

 

Procedurę sporządzono na podstawie  http://www.protocol-online.org/

 

 

stat


Sprzęt

Reklama