Molekularna

  • Zwiększ rozmiar czcionki
  • Domyślny  rozmiar czcionki
  • Zmniejsz rozmiar czcionki

Opracowanie warunków PCR

Email Drukuj

 

Podstawową reakcją wykorzystywaną w biologii  molekularnej jest reakcja łańcuchowa polimerazy (z ang. PCR). Służy ona do selektywnego powielania materiału genetycznego. Składa się z szeregu cykli temperaturowych dostosowanych do konkretnie optymalizowanej metody. Niniejsze opracowanie podaje podstawowe informacje niezbędne do zaprojektowania i optymalizacji własnej reakcji PCR.

 

I. Startery (primery) reakcji.

Pierwszym krokiem jest odpowiednie zaprojektowanie starterów reakcji. Startery są to krótkie odcinki jednoniciowego DNA. Starter forward jest komplementarny do nici wstępującej, a starter reverse jest komplementarny do nici zstępującej. Zaprojektowane są tak aby oflankowywały fragment, który chcemy powielić. Innymi słowy powielony zostanie fragment zawarty pomiędzy starterami. 3' koniec musi być idealnie zgodny z sekwencją matrycową (ostatnie 5 nukleotydów), natomiast 5' koniec może pozostać wolny (np. w przypadku starterów zdegenerowanych).

Startery projektuje się, a następnie syntetyzuje chemicznie. W większości są one o długości 15-25 par zasad (najczęściej ok. 20 pz).   Ważne jest aby dobrać je tak by temperatury topnienia obu używanych starterów były takie same (lub zbliżone). Optymalnie startery reakcji zawierają 40-60% zasad G+C. Należy unikać bloków G lub C większych niż 2 nukleotydy. Przed syntezą powinno się również sprawdzić czy nie tworzą w roztworze dimerów oraz struktury drugorzędowe. Do tego celu służą licznie umieszczane w internecie kalkulatory PCR.

Startery najczęściej dodaje się do reakcji w ilości 50 pmol na 50ul reakcji.

II. Stężenie chlorku magnezu.

Stężenie jonów magnezu ma kluczowe znaczenie w reakcji polimerazy, dopiera się je eksperymentalnie. Magnez wchodzi w skład kompleksu, który tworzą dNTPy, starter oraz matrycowe DNA. Optymalne stężenie jonów w reakcji mieści się w granicach 1-4 mM. Zbyt małe stężenie powoduje znaczny spadek wydajności reakcji, natomiast zbyt duże skutkuje powstawaniem produktów niespecyficznych oraz pomyłkami polimerazy w podstawianiu nukleotydów. Należy pamiętać, że jeżeli bufor do PCR zawiera związki chelatujące jony dwuwartościowe (np. EDTA) stężenie Mg+2 należy proporcjonalnie zwiększyć.

III. Polimeraza.

Zalecane jest użycie 1-1.5u Taq polimerazy na 50 ul reakcji. Zwiększenie stężenia w małym stopniu poprawia wydajność reakcji natomiast może znacznie zwiększać powstawanie produktów niespecyficznych. W przypadku występowania inhibitorów w roztworze matrycowego DNA (jak np. pozostałości etanolu) można użyć większej ilości polimerazy (2-3u) co powinno zwiększyć wydajność reakcji.

Należy pamiętać, że polimeraza jest przechowywana w roztworze zawierającym ok 50% glicerol. Dlatego pipetowanie bardzo małych objętości (0.5-2 ul) może powodować duży błąd (lepki roztwór pozostaje na zewnętrznych ściankach końcówki). Aby tego uniknąć zalecane jest przygotowywanie mastermix'ów zawierających bufor reakcyjny, dNTPy oraz polimerazę, a następnie porcjowanie takiej mieszaniny do poszczególnych probówek PCR.

IV. dNTPy

Stężenie każdego z dideoksynukleotydów w standardowej reakcji wynosi 200 uM. Ważne jest aby stężenia wszystkich czterech były identyczne. Przewaga któregokolwiek z nukleotydów drastycznie zwiększa prawdopodobieństwo powstania błędu w przyłączaniu nukleotydów (typu misincorporation). Zwiększenie stężenia nukleotydów powoduje wzrost wydajności reakcji, jednakże należy pamiętać że może to też powodować powstawanie błędów. Dlatego jeśli chcemy uzyskać produkt o bardzo dokładnie odwzorowany należy użyć nukleotydów o stężeniu 10-50uM. Wydajność takiej reakcji można podnieść odpowiednio zwiększając stężenie jonów magnezu.

V. Matryca

Najczęściej stężenie matrycy waha się od 0.01-1 ng DNA plazmidowego,  fagowego lub 0.1-1 ug DNA genomowego (w 50 ul reakcji). Zwiększanie stężenia matrycy nieznacznie powoduje wzrost wydajności reakcji natomiast dodatnio wpływa na tworzenie się produktów niespecyficznych. Stopień oczyszczenia DNA ma zasadniczy wpływ na prowadzoną reakcję PCR. Ślady soli (szczególnie dwuwartościowych), etanolu, fenolu, formaldehydu itp inhibuje reakcję.

VI. Profil temperaturowy.

Każda reakcja PCR składa się z cyklicznie powtarzanych etapów. Charakteryzują się one różną temperaturą i czasem prowadzenia. Reakcja jzachodzi w probówkach reakcyjnych umieszczonych w urządzeniu zwanym termocyklerem. Posiada on blok grzejny, który odpowiednio szybko potrafi zmieniać temperaturę (grzanie i chłodzenie w tempie ok. 1oC/s).

Główne etapy standardowej reakcji PCR:

  1. Denaturacja wstępna -  służy do wstępnej denaturacji matrycy. Prowadzi się ten etap w temperaturze 94-95oC przez 3-5 minut. W przypadku stosowania polimerazy blokowanej chemicznie (tzw. Hotstart) etap ten należy wydłużyć do ok. 15 minut (wg dołączonej do polimerazy instrukcji). Jeśli używa się polimerazy modyfikowanej przeciwciałami (tzw. Hotstart) inkubacja może być prowadzona w standardowym czasie. Denaturację wstępną należy przedłużyć (do 10 minut) w przypadku amplifikacji matrycy bogatej w pary GC.
  2. Cykle PCR - jest to właściwa część syntezy DNA. Składa się najczęściej z trzech kroków powtarzanych cyklicznie 30-40 razy:
    • denaturacja (94-95oC) - krok ten służy do denaturacji matrycowego DNA czyli zerwania wiązań wodorowych między niciami, produktem jest jednoniciowe DNA; zależnie od wielkości matrycy prowadzi się ten krok przez 30-120 sekund;
    • przyłączanie starterów/annealing (40-60oC) - w tym kroku startery reakcji przyłączają się do matrycowego DNA, temperatura zależy od temperatury topnienia starterów; polecana jest optymalizacja etapu przyłączania starterów przy użyciu gradientowego termocyklera; ustawia się w nim gradient temperatury przyłączania w zakresie od Tm-5oC do Tm+5oC; podwyższanie temperatury przyłączania powoduje zwiększenie specyficzności reakcji ale też spadek wydajności reakcji;
    • wydłużanie/elongacja (70-72oC) - w tym kroku zachodzi budowy nici DNA na danej matrycy; prowadzi się go najczęściej w czasie ok. 30 sekund; w przypadku dłuższych fragmentów (powyżej 1000 par zasad) czas ten należy wydłużyć (1 min na każde 1000 par zasad).
  3. Końcowe wydłużanie - służy do uzupełnienia nie do końca zsyntetyzowanych fragmentów etap ten standardowo prowadzi się w temperaturze 72oC przez 10-20 minut.

Dokładne czasy i temperatury należy dobrać eksperymentalnie dla każdego rodzaju reakcji.

 

 

 

 

stat


Sprzęt

Reklama