Molekularna

  • Zwiększ rozmiar czcionki
  • Domyślny  rozmiar czcionki
  • Zmniejsz rozmiar czcionki

PCR - wprowadzenie

Email Drukuj

Reakcja ta służy do powielenia wybranego fragmentu DNA i jest katalizowana przez specyficzny enzym - polimerazę. Enzym ten powoduje polimeryzację deoksynukleotydów, a po raz pierwszy został wyizolowany z termofilnej sinicy: Thermus aquaticus . Jak wszystkie polimerazy enzym ten do rozpoczęcia reakcji potrzebuje matrycowego DNA oraz specyficznych starterów reakcji. Ponieważ synteza przebiega na obu niciach DNA to do reakcji używane są dwa startery tzw.: „forward” i „reverse”. Startery są to krótkie odcinki DNA (ok 20 par zasad), syntetyzowane sztucznie i tak zaprojektowane przez eksperymentatora aby oflankowywały fragment genu, który powinien zostać powielony. Starter „forward” jest komplementarny do nici wstępującej, natomiast starter „reverse” do nici zstępującej.

Reakcja PCR jest składa się z kilku etapów. W pierwszym następuje kilku minutowa (3-5 minut) denaturacja materiału genetycznego prowadzona w temperaturze 94-95oC. Kolejny etap składa się z kilkudziesięciu cykli (liczba cykli jest dobrana eksperymentalnie w przedziale 30-45), a w każdym cyklu temperatura próbki zmienia się trzykrotnie: w temperaturze 94-95oC następuje rozdzielenie podwójnej nici DNA na dwie pojedyncze, w temperaturze 40-70 oC następuje przyłączenie starterów reakcji oraz polimerazy DNA; w temperaturze 72 oC następuje synteza drugiej nici DNA. Ostatnim etapem reakcji jest inkubacja próbki w 72 oC w celu uzupełnienia ewentualnych niedosyntatyzowanych odcinków podwójnego DNA.

Reakcja PCR jest prowadzona w specjalistycznym urządzeniu zwanym termocyklerem. Termocykler charakteryzuje się tym, że utrzymuje bardzo dokładną temperaturę w naczyniu reakcyjnym oraz może ją bardzo szybko zmienić. Podczas programowania urządzenia ustala się odpowiednie profile temperaturowe oraz czasy inkubacji. W wyniku reakcji otrzymuje się kilkadziesiąt miliardów kopii DNA o wielkości założonej przez eksperymentatora.

Ta prosta metoda służy jako podstawa do wielu technik molekularnych używanych do diagnostyki genetycznej.

 

stat


Sprzęt

Reklama