Molekularna

  • Zwiększ rozmiar czcionki
  • Domyślny  rozmiar czcionki
  • Zmniejsz rozmiar czcionki

Zastosowanie Taq polimerazy w biologii molekularnej.

Email Drukuj

 

 

I. Wstęp

Polimeraza DNA jest enzymem, który katalizuje syntezę DNA. Substratem reakcji są wolne nukleotydy (w reakcji PCR: trifosforany dezoksyrybonukleozydów - dNTPs) oraz matrycowa, jednoniciowa cząsteczka DNA. Synteza prowadzona jest od 5’ do 3’ końca. Warunkiem zapoczątkowania reakcji jest przyłączenie do matrycowego DNA sekwencji starterowych (krótkich odcinków jednoniciowego DNA).

Historycznie pierwszą polimerazą używaną w technikach biologii molekularnej była termostabilna polimeraza izolowana z bakterii Thermus aquaticus. Charakteryzuje się ona wysoką stabilnością w szerokim zakresie temperatur (35-95oC). Opytymalne działanie tej polimerazy notuje się w temperaturze około 70oC. Powyższe właściwości umożliwiły jej wykorzystanie do reakcji PCR, która jest prowadzona w profilach temperaturowych między 40 a 95oC (patrz: Opracowanie warunków PCR).

II. Modyfikacje Taq Polimerazy

Obecnie rzadko używa się polimerazy izolowanej z termofilnych bakterii. W sprzedaży są głównie enzymy otrzymane technikami klonowania (najczęściej w E. coli). Dodatkowo są one modyfikowane tak, aby poprawić aktywność lub specyficzność enzymu. Wyróżnia się klasyczne polimerazy do standardowego DNA, polimerazy z wprowadzoną naprawą błędów (proofreading) – szczególnie wykorzystywane do sekwencjonowania, polimerazy do tzw. long-range PCR wykorzystywane do syntezy długich fragmentów DNA (powyżej 1500 par zasad).

Jedną z nowatorskich i popularnych modyfikacji jest opracowanie tzw. polimerazy Hot Start. Enzym ten jest modyfikowany w ten spsób, że blokowane jest jego centrum aktywne i aby nabrać właściwości enzymatycznych musi zostać aktywowany. Najczęściej dzieje się to przez ogrzanie przez 15-20 minut w temperaturze ok. 95oC. Dzięki tej modyfikacji polimeraza dodawana do mieszaniny reakcyjnej jest nieaktywna. Dopiero jej aktywacja już w termocyklerze powoduje, że reakcja zaczyna zachodzić w ściśle kontrolowanych warunkach. Ważne to jest szczególnie przy pracy z wieloma próbkami, gdzie istnieje spora różnica czasowa pomiędzy dodawaniem materiału z pierwszej i ostatniej próbki. Zastosowanie modyfikowanej polimerazy (typu Hot Start) powoduje, że niezależnie od liczby próbek reakcja w każdej zaczyna się w tym samym momencie. Otrzymujemy dzięki temu znacznie czystszy i bardziej jednorodny produkt.

III. Polimeraza blokowana przeciwciałami.

Jedną z najnowoczesniejszych grup polimeraz stanowią enzymy, w których centrum aktywne jest blokowane przeciwciałami. Przykładem takiego rozwiązania jest polimeraza TaKaRa Taq™ DNA Polymerase Hot Start Version (dystrybutor firma Biokom). W formie natywnej zablokowanie przeciwciałami centrum aktywnego enzymu uniemożliwia prowadzenie reakcji. Podgrzanie enzymu powoduje denaturację przeciwciała oraz odblokowanie centrum aktywnego.

Do aktywacji enzymu TaqHS wystarczy umieszczenie próbki w temperaturze 98oC przez 5-10 sekund lub w 94oC przez 20-30 sekund. Aktywacja przebiega więc podczas pierwszego kroku reakcji PCR – wstępnej denaturacji. Nie ma potrzeby stosowania dodatkowych inkubacji w wysokich temperaturach. Takie działanie tego enzymu nie tylko oszczędza czas, ale również zmniejsza narażenie polimerazy na wysoką temperaturę, co poprawia wydajność reakcji PCR.

IV. Podsumowanie

Dobór odpowiedniego enzymu jest jednym z kluczowych etapów projektowania reakcji PCR. Zależnie od rodzaju próbki wejściowej oraz otrzymywanych sekwencji należy podjąć decyzję o zastosowaniu konkretnego enzymu od konkretnego producenta. Warto pamiętać, że enzymy produkowane są w różnym stopniu czystości, dlatego warto kupować je u znanych i dużych producentów z wieloletnim doświadczeniem w produkcji odczynników do biologii molekularnej. Godne polecenia są również polimerazy typu Hot Start – szczególnie blokowane przeciwciałami ze względu na wysoką specyficzność oraz wydajność.

Rys. Amplifikacja fragmentu genu kodującego czynnik V (FV). A – polimeraza TaKaRa TaqTM HS (Biokom, TaKaRa), M – marker masy, B – polimeraza Taq

Artykuł sponsorowany.

 

stat


Sprzęt

Reklama