Molekularna

  • Zwiększ rozmiar czcionki
  • Domyślny  rozmiar czcionki
  • Zmniejsz rozmiar czcionki

FISH – fluorescencyjna hybrydyzacja in situ

Email Drukuj

FISH (Fluorescent in situ hybridization) – fluorescencyjna hybrydyzacja in situ to jedna ze starszych metod cytogenetyki molekularnej, opracowana we wczesnych latach 80’. Początkowo wykorzystywano w niej znaczniki radioaktywne, które dość szybko zastąpiono w pełni bezpiecznymi barwnikami fluorescencyjnymi. Metoda FISH oparta jest na hybrydyzacji kwasów nukleinowych: matrycy, czyli DNA pacjenta w postaci chromosomów metafazalnych (czasem na jadrach interfazowych z bloczków parafinowych lub rozmazach,etc.) oraz fluorescencyjnie znakowanej sondy, także DNA, komplementarnym do badanego regionu. Hybrydyzacja przebiega na szkiełku mikroskopowym, czyli in situ (w miejscu).

Zależnie od wielkości i przeznaczenia sondy fluorescencyjnej dzieli się je na:

1) sondy malujące (WCP, Whole Chromosome Painting) pokrywające cały wybrany chromosom, lub jego ramię (arm specific), sondy te pokrywają obszar od kilku do kilkudziesięciu milionów par zasad;

2) sondy centromerowe (CEP – Centromeric Enumeration Probes), charakterystyczne dla poszczególnych chromosomów, pozwalające zidentyfikować dany centromer; sondy te można obserwować zarówno na chromosomach metafazalnych, jak i na jądrach interfazalnych, a osiągają one wielkość kilkudziesięciu tysięcy par zasad;

3) sondy specyficzne (LSI – Locus Specific Identifier) komplementarne do określonego regionu chromosomu, podobnie jak sondy centromerowe mają one wielkości rzędu kilkudziesięciu tysięcy par zasad i są widoczne zarówno na chromosomach jak i w interfazach. Do tej grupy zaliczane są:

a) sondy do diagnostyki zespołów genetycznych w tym mikrodelecyjnych i mikroduplikacyjnych np. zespołu Williamsa, diGeoge’a, Miller-Dieckera, Pradera-Willego i innych,

b) sondy subtelomerowe – znakujące i identyfikujące fragmenty dystalne chromosomów,

c)  sondy hematoonkologiczne oraz sondy do diagnostyki guzów litych – sondy dla określonych regionów chromosomów ulegających zmianom w danym typie nowotworu (np. delecjom, duplikacjom, translokacjom), służące do diagnostyki  białaczek, chłoniaków, mięsaków i innych nowotworów;

d) sondy do diagnostyki preimplantacyjnej i prenatalnej, zwykle połączone w zestawy umożliwiające szybką diagnostykę najczęstszych aneuploidii chromosomowych.

Obecnie na rynku polskim sprzedawane są sondy kilku producentów. Posiadają one zwykle certyfikaty CE, co umożliwia prowadzenie przy ich użyciu diagnostyki genetycznej.

Laboratorium genetyczne (nie prowadzące diagnostyki nowotworów) posługujące się techniką FISH posiada zwykle na stanie kilkadziesiąt różnych sond, z czego najczęściej stosowane są sondy na określone zespoły mikrodelecyjne (np. zespół diGeorge’a, Williamsa, Pradera-Willego), sondy subtelomerowe oraz centromerowe (w tym koniecznie dla X i Y).

Natomiast laboratoria zajmujące się diagnostyką nowotworów dysponują ściśle określonym panelem sond, zależnie od ich zakresu diagnostycznego. Liczba dostępnych na rynku sond zawiera kilkaset pozycji i ciągle jest uzupełniana. Można ją znaleźć np. na stronie internetowej dystrybutora sond firmy Vysis www.biovigen.pl lub na stronie ich producenta http://www.abbottmolecular.com/technologies/fish/vysis-chromosome-search.html.

Przygotowanie preparatów do badania FISH i samo badanie nie jest trudne.

Podana niżej procedura dotyczy sond firmy Vysis, przy czym oczywiście aktualizowane procedury należy okresowo sprawdzać na stronie producenta http://www.abbottmolecular.com/technologies/fish.html. Dostępny jest na tej stronie także bardzo użyteczny graficzny katalog sond wraz z nazwami loci http://www.abbottmolecular.com/technologies/fish/vysis-chromosome-search.html.

Procedura badania FISH z użyciem sondy firmy Vysis

Uwaga: badanie FISH wykonujemy w beztalkowych rękawiczkach.

  1. Przygotowanie szkiełka z preparatem: na szkiełko podstawowe nanieść 30 ul osadu limfcytów/amniocytów w nagrzanej do 60oC łaźni wodnej. Można pozostawić szkiełko 10 minut w otwartej łaźni na stelażu. Sprawdzić pole hybrydyzacyjne w mikroskopie kontrastowo-fazowym i zaznaczyć je diamentem;
  2. Szkiełko wysuszyć i odłożyć na noc lub dłużej (można też po około godzinnym suszeniu  w cieplarce w 37oC przejść do następnego kroku, ale jakość badania może być gorsza);
  3. Starzenie preparatu: inkubować szkiełko 1h w buforze 2xSSC o temperaturze 37*C lub 5 min w buforze 2xSSC w 73oC. Bufor 2xSSC najwygodniej sporządza się poprzez rozcieńczanie gotowego 20xSSC;
  4. Odwodnienie preparatu (szereg alkoholowy): kolejno inkubować szkiełko przez 1 min w 75%, 80% i 100% etanolu (ważne, żeby te odczynniki trzymać w szczelnie zakręcanych butelkach i regularnie wymieniać, bo etanol chłonie wodę z powietrza i zmienia stężenie);
  5. Szkiełko wysuszyć na powietrzu przez około 3 minuty lub krótko na płycie grzejnej o temperaturze 40oC;
  6. Przygotować wcześniej sondę wg instrukcji producenta mieszając ją z buforem do hybrydyzacji (niektóre sondy sprzedawane są gotowe do użycia). Należy pamiętać, że sondy sprzedawane w komplecie z buforem i przechowywane w zamrażarce trzeba najpierw rozmrozić i dobrze wymieszać;
  7. Nałożyć sondę na obszar hybrydyzacyjny i nakryć czystym szkiełkiem nakrywkowym łapiąc je za brzegi. Należy uważać, żeby pod szkiełkiem nakrywkowym nie było pęcherzyków powietrza. Nie należy też dotykać  powierzchni szkiełka nakrywkowego, bo można je zatłuścić;
  8. Zakleić brzegi szkiełka klejem do FISH (niemiecki fixogum);
  9. Włączyć płytę grzejną nastawioną na 73*C, poczekać aż klej wyschnie (najlepiej około 10 min w cieplarce); alternatywą do płyty grzejnej jest urządzenie  Thermobrite umożliwiające przeprowadzenie zarówno procesu kodenaturacji (jednoczesnej denaturacji DNA pacjenta oraz sondy FISH) jak i hybrydyzacji, odpowiednie zaprogramowanie temperatur i czasu oraz zapewniające stałe warunki dla tych procesów,


  10. http://www.abbottmolecular.com/products/instrumentation-automation/fish/thermobrite.html

  11. Położyć szkiełko na płytę grzejną na 2 minuty lub zaprogramować Thermobrite na 2 minuty denaturacji (czas kodenaturacji jest różny zależnie od typu preparatu/sondy, zwykle waha się od 2 do 5 minut);
  12. Włożyć szkiełko do komory wilgotnej (dobrze sprawdza się np. pudełko po końcówkach z wodą na dnie, szkiełko kładziemy na górę, przykrywamy pokrywką  i całość owijamy folia aluminiową lub wkładamy do woreczka strunowego; jeśli dysponujemy Thermobritem po denaturacji urządzenie obniży temperaturę do 37oC;
  13. Włożyć komorę do cieplarki na noc (ale można też zostawić badanie w cieplarce dłużej, np. 24-48h, nie należy raczej natomiast skracać czasu hybrydyzacji poniżej 16-18 godzin);
  14. Następnego dnia ściągnąć klej i szkiełko nakrywkowe delikatnie je zsuwając pęsetą, szkiełko włożyć do 0,4xSSC z 0,1% tweenem lub NP40 o temperaturze 73oC  na 2 minuty (czas i temperatura też zależą od rodzaju sondy i preparatu). Bardzo ważne jest wcześniejsze umieszczenie buforu w łaźni wodnej i sprawdzenie jego temperatury przed płukaniem;
  15. Przełożyć szkiełko do 2xSSC o temperaturze pokojowej na około 30 sekund;
  16. Odsączyć szkiełku na ręczniku papierowym i nałożyć DAPI nakrywając pole hybrydyzacyjne szkiełkiem nakrywkowym;
  17. Wykonać analizę pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Ważne:

Do przygotowania badania FISH używamy rękawiczek beztalkowych.

Kontrolujemy temperatury płyty i buforów (tolerancja +/- 1oC).

Po odwodnieniu szybko nakładamy sondę, bo inaczej preparat wchłonie wodę z powietrza.

Jeśli używamy kominków (barwiaczy Hellendahla), które mają objętość 50 ml, nie powinniśmy do nich wkładać więcej jak 4 szkiełek na raz.

Należy chronić sondy FISH przed światłem.

DAPI jest toksyczne.

20xSSC można sporządzić z poszczególnych składników, lub prościej z przygotowanej przez producenta mieszanki soli wymagającej tylko rozpuszczenia w odpowiedniej objętości wody.

Opisana metoda została dopracowana przez autorów artykułu. Jednakże nie biorą oni odpowiedzialności za jej działanie.

Protokoły dla poszczególnych sond dostępne są na stronie producenta w dziale SUPPORT -Instruction for Use https://www.abbottmolecular.com/instructions-for-use.html

W przypadku pracy z innymi preparatami niż te uzyskane po hodowli limfocytów, amniocytów, fibroblastów czy komórek szpiku, czyli np. w przypadku preparatów z bloczków parafinowych lub amniocytów niehodowanych, bezpośrednio izolowanych z płynu owodniowego, a wymagających specjalnego potraktowania przed badaniem FISH użytecznym ułatwieniem pracy są gotowe zestawy do tzw. „preatreatment’u”, http://www.abbottmolecular.com/products/general-purpose-reagents/fish/pretreatment-kit.html.

Ważnym elementem badania FISH jest analiza obrazu uzyskanego z preparatu w mikroskopie fluorescencyjnym. Konieczne jest do tego odpowiednie oprogramowanie (mikroskop połączony jest z kamerą, która zbiera obraz i przekazuje do komputera). Obecnie firma  Biovigen posiada w ofercie system do analizy obrazu BioView kompatybilny z mikroskopem firmy Olympus. System nie wymaga przeprowadzania analizy w ciemnym pomieszczeniu, gdzie zbierane są obrazy z mikroskopu, ponieważ analizę można wykonać na ekranie dotykowym w jasnym pomieszczeniu przekazując obrazy do analizy poprzez sieć. Czas skanowania obszaru hybrydyzacyjnego wynosi około 5 minut, czas analizy ok. 1 min.

Wydaje się, że w dobie CGH do mikromacierzy (aCGH) oraz sekwencjonowania nowej generacji (NGS) technika FISH, wkrótce zniknie z rynku diagnostycznego – nic bardziej mylnego. FISH jest używany do potwierdzania wyników uzyskanych z aCGH, jest też badaniem z wyboru u pacjentów, u których można postawić konkretne rozpoznanie (np. zespół Williamsa, diGeorge’a), jest też jedną z technik umożliwiającą kompleksową diagnostykę najczęstszych aneuploidii zarówno w badaniach prenatalnych jak i preimplantacyjnych, a także diagnostykę aberracji charakterystycznych dla niektórych nowotworów. FISH umożliwia tez potwierdzenie lub wykluczenie aberracji chromosomowych zdiagnozowanych za pomocą cytogenetyki klasycznej (jeśli potwierdzenia wymagają), a także szybkie zliczanie odsetka komórek z aberracją w przypadku mozaicyzmu. Oprócz mikroskopu fluorescencyjnego z odpowiednim oprogramowaniem nie wymaga właściwie innego wysoce specjalistycznego sprzętu. Jest to technika, która obok jeszcze starszej cytogenetyki klasycznej jest w pewnych przypadkach nie do zastąpienia.

 

Artykuł sponsorowany.

 

stat


Sprzęt

Reklama