Molekularna

  • Zwiększ rozmiar czcionki
  • Domyślny  rozmiar czcionki
  • Zmniejsz rozmiar czcionki

Porównawcza hybrydyzacja genomowa do mikromacierzy w badaniach diagnostycznych

Email Drukuj

 

CGH do mikromacierzy (aCGH, array Comparative Genomic Hybridization, porównawcza hybrydyzacja genomowa do mikromacierzy) to metoda cytogenetyki molekularnej, która jest nowocześniejszą i niewątpliwie lepszą wersją starszej metody CGH wprowadzonej do badań naukowych i diagnostyki genetycznej przez Kalionniemi i wsp. w 1992 roku.

W metodzie CGH cały genom referencyjny (prawidłowy) w postaci DNA wyznakowanego fluorescencyjnie oraz genom badany (w postaci wyznakowanego DNA uzyskanego od pacjenta) porównywane są ze sobą, co pozwala na określenie różnic ilościowych pomiędzy tymi genomami.

Aby porównać ze sobą oba genomy jako „podkładki” do ich hybrydyzacji używa się trzeciego genomu w postaci uporządkowanej, czyli metafaz na szkiełku mikroskopowym. W ten sposób dwa różnokolorowe genomy pocięte enzymatycznie na niewielkie fragmenty organizują się ponownie na chromosomach na zasadzie komplementarności i konkurencji o miejsce do hybrydyzacji. Wszelkie różnice ilościowe pomiędzy nimi widoczne są w postaci przewagi jednego koloru nad drugim, co można stwierdzić używając mikroskopu fluorescencyjnego z odpowiednim oprogramowaniem do analizy.

Podstawową wadą klasycznej metody CGH jest jednak jej niska rozdzielczość wynikająca z rozdzielczości metafaz, wynosząca średnio 3-5 Mpz. Wada ta została zlikwidowana w technice aCGH, gdzie „podkładką” jest mikromacierz, czyli ludzki genom zimmobilizowany na specjalnej płytce (szkiełku) w postaci populacji oligonukleotydów, umieszczonych w ściśle określonym porządku w setkach tysięcy, a nawet milionie dołków. Rozdzielczość aCGH zależy od rodzaju macierzy i wynosi od kilkuset tysięcy do kilku nukleotydów. Wybór rozdzielczości zależy od liczby punktów pomiarowych na macierzy: np. standardowo dla badania przyczyn niepełnosprawności intelektualnej u dzieci używa się macierzy 180k (180 tysięcy punktów pomiarowych) co daje średnią rozdzielczość około 100-300 tysięcy par zasad, ale istnieją także macierze 1M (milion punktów pomiarowych) o rozdzielczości, zależnie od regionu genomu, nawet do kilkunastu par zasad. Szeroką gamę macierzy o różnej rozdzielczości, również z możliwością projektowania własnych oferuje firma Agilent http://www.genomics.agilent.com/en/home.jsp, której dystrybutorem w Polsce jest firma Perlan Technologies www.bio.perlan.com.pl.

Samo przeprowadzenie badania aCGH nie jest trudne, choć oczywiście wymaga doświadczenia w pracy laboratoryjnej i odpowiedniego poziomu wiedzy. Bardzo ważnym elementem jest jakość DNA uzyskanego od pacjenta, jego stężenie i czystość. Wszystkie kolejne etapy, czyli przygotowanie DNA do znakowania, samo znakowanie fluorescencyjne oraz oczyszczanie uzyskanych produktów zależą głównie od jakości DNA. Obecnie dostępne na rynku zestawy do znakowania zawierają proste instrukcje i pozwalają zamknąć proces przygotowania próbki do hybrydyzacji w 24h. Sama hybrydyzacja zależnie od rodzaju macierzy zajmuje od 24 do 48 godzin.

Sprzęt jakim musi dysponować laboratorium, oprócz drobnego, to sprzęt do pomiaru i określania czystości DNA, dobrej jakości termocykler, piec hybrydyzacyjny i oczywiście skaner do mikromacierzy, który jest najdroższym elementem. Na rynku dostępne są skanery działające w systemach zamkniętych, ale istnieją także takie, które skanują macierze innych producentów, niż producent skanera (np skaner firmy Agilent), co umożliwia zastosowanie różnych macierzy. Jest to szczególnie ważne w pracy naukowej, wymagającej niestandardowego podejścia.

W diagnostyce genetycznej aCGH to technika, której nie sposób przecenić, o czym świadczy również jej bardzo szybki rozwój i obecność we większości genetycznych laboratoriów diagnostycznych w krajach rozwiniętych. Macierze CGH są powszechnie używane do badania przyczyn niepełnosprawności intelektualnej i dysmorfii u dzieci. Stosuje je się również do diagnostyki prenatalnej, co pozwala wykluczyć u płodu nie tylko aneuploidie, ale także zespoły mikrodelecyjne i niezrównoważone zmiany w genomie. CGH do mikromacierzy obecne jest już także w diagnostyce preimplantacyjnej przy zapłodnieniu in vitro, ponieważ możliwa jest analiza genomu z jednej komórki pobranej z pięciodniowego  blastocytu. Po lizie komórki następuje amplifikacja całego jej materiału genetycznego przy użyciu metody MDA (Multiple Displacement Amplification), czyli amplifikacja bez użycia reakcji łańcuchowej polimerazy. Polega ona na przyłączeniu haksamerowych losowych starterów do DNA i zastosowaniu Ɵ29 polimerazy w celu powielenia materiału genetycznego. Tak przygotowane DNA może być użyte do aCGH.

CGH do mikromacierzy stosuje się też powszechnie w badaniach podstawowych, np. w badaniu niestabilności chromosomowej i poszukiwaniu krytycznych zmian w genomie  nowotworowym.

Obecnie, macierze do badania niezrównoważonych zmian w genomie, tzw. macierze kliniczne, dostępne są z możliwością sprawdzenia heterozygotyczności badanych sekwencji poprzez analizę SNP (Single Nucleotide Polymorphism, polimorfizm pojedynczego nukleotydu), co pozwala na stwierdzenie uniparentalnej disomii (obecności dwóch kopii danego fragmentu genomu od jednego rodzica, przy braku kopii od drugiego rodzica), co może być przyczyną takich zespołów genetycznych jak zespół Pradera-Willego, Angelmana, Silvera-Russella czy Beckwitha –Wiedemanna.

 

Wśród wyników uzyskanych z CGH do mikromacierzy można wyróżnić kilka grup:

· duże zmiany powyżej miliona par zasad (te powyżej kilku milionów są zwykle możliwe do zidentyfikowania w cytogenetyce klasycznej),

· mikrodelecje i mikroduplikacje charakterystyczne dla konkretnych zespołów chorobowych, możliwe do identyfikacji za pomocą metody FISH (Fluorescent in situ Hybridization, fluorescencyjna hybrydyzacja in situ), przy zastosowaniu odpowiedniej sondy FISH http://www.genomics.agilent.com/surefish-home.jsp,

· małe niespecyficzne zmiany poniżej miliona par zasad (wymagające weryfikacji), tu również można zastosować którąś z sond proponowanych przez firmę Agilent, dedykowanych do różnych i licznych fragmentów genomu; lista ta ciągle jest poszerzana,

· LOH (loss of heterozygosity) utrata heterozygotycznści w określonym regionie – jeśli jest charakterystyczna dla danego zespołu genetycznego, możliwe jest postawienie rozpoznania klinicznego.

Dużym problemem w analizie wyników uzyskanych dzięki aCGH jest różnorodność ludzkiego genomu i obecne w nim CNVs (Copy Number Variants), zmiany liczby kopii niektórych regionów będące wariantami polimorficznymi, czyli formą prawidłową. W przypadku odkrycia takiej zmiany u pacjenta z dysmorfią, konieczne jest wtedy badanie rodziców, co pozwala na określenie pochodzenia zmiany i ewentualne jej pominięcie w diagnozie jeśli dziecko odziedziczyło ją od zdrowego rodzica. W przypadku zmian de novo, wyciągniecie właściwych wniosków nie jest już takie łatwe, ale pomagają w tym odpowiednie programy komputerowe i bazy danych.

Analiza wyników uzyskanych z macierzy ze względu na ich specyficzną formę (tysiące punktów na szklanej płytce o różnej intensywności fluorescencji) oraz liczbę danych wymaga zastosowania specjalistycznego oprogramowania. Zwykle oprogramowanie to jest dostarczane przez producenta macierzy i dedykowane do tych macierzy i umożliwia określenie jakości badania, sprawdzenie czy zachowane są wszystkie parametry konieczne do uzyskania wiarygodnego wyniku, a także analizę danych, umiejscowienie zmian w genomie i określenie charakteru danej zmiany.

Oprogramowanie do analizy aCGH powinno być intuicyjne i ułatwiać, a nie komplikować pracę. Firma Agilent do analizy wyników udostępnia program Cytogenomics, który pozwala na personalizację, załączanie dodatkowych ścieżek, potrzebnych do analizy i interpretacji danych (np. uzupełnianie bazy o nowe zespoły mikrodelecyjne lub wcześniej zbadane CNVs), a także bezpośrednie łączenie się z internetowymi bazami zawierającymi informacje na temat zmian w ludzkim genomie, takich jak OMIM. http://www.genomics.agilent.com/en/CGH-Microarray-Data-Analysis/Agilent-CytoGenomics-Software/?cid=AG-PT-111&tabId=AG-PR-1017. Szybkie przejście od własnego rezultatu do informacji w bazach danych usprawnia analizę wyników, która tak naprawdę jest najtrudniejszą i najbardziej czasochłonną częścią badania aCGH.

CGH do mikromacierzy to obecnie technika pierwszego wyboru w diagnostyce dzieci z dysmorfią i niepełnosprawnością intelektualną, ale niestety jeszcze nie w Polsce. Nie jest to związane z dostępnością sprzętu czy brakiem odpowiednio wyszkolonego personelu, bo taki w Polsce jest, lecz z ofertą finansową NFZ, który na diagnostykę genetyczną przeznacza wciąż niewystarczające kwoty. CGH do mikromacierzy staje się jednak techniką coraz bardziej dostępną i z roku na rok tańszą, co daje nadzieję, że aCGH wejdzie na stałe do diagnostyki genetycznej także w naszym kraju.

Artykuł sponsorowany.

 

stat


Sprzęt

Reklama