Szybka izolacja DNA genomowego z krwi obwodowej

Publicysta
Drukuj

 

 

Kolejna szybka izolacja DNA genomowego z krwi obwodowej pobranej na EDTA.

 

BUFORY:

1. Bufor lizujący A

0.32M sacharoza

10mM tris-HCl pH 7.6

5mM MgCl2

0.75% Triton X100

2. Bufor B

20mM Tris-HCl pH 7.4

4mM EDTA

100mM NaCl

 

PROCEDURA:

1. Do 100ul krwi pobranej na EDTA dodać 100ul buforu lizującego A oraz 200ul wody (silnie schłodzona dH2O). Silnie wymieszać (Vortex), następnie inkubować na lodzie 2-3 minuty.

2. Wirować 3500rpm przez 15 minut (4oC).

3. Zlać supernatant, osad zawiesić w 2ml buforu lizującego A oraz 6 ml wody.

4. Wirować 3500rpm przez 15 minut (4oC).

5. Zlać supernatant. Jeśli osad jest biały przejść do punktu 6, jeśli osad jest czerwony lub różowy powtórzyć punkty 3-4.

6. Osad rozpuścić w 5 ml buforu B. Dodać 500ul 10% SDS'u. Intensywnie mieszać (Vortex) przez 30-60 sekund. Dodać 50ul proteinazy K (20mg/ml).

UWAGA!!! Proteinaza K powinna być przygotowywana na świeżo lub przechowywana w zamrażarce (-20oC).

7. Inkubować 2 godziny w 55oC. Po inkubacji w celu schłodzenia przenieść próbki na 2-3 minuty na lód. Dodać 4ml 5.3M NaCl. Intensywnie mieszać (Vortex) przez 15 sekund.

8. Wirować 4500rpm przez 15-20 minut (4oC).

9. Ostrożnie przelać supernatant do drugiej probówki (uważać żeby nie naruszyć osadu). Dodać taką samą objętość zimnego izopropanolu (-20oC). Wymieszać poprzez odwracanie probówki 5-6 razy.

10. Sterylną końcówką przenieść kłaczki DNA do drugiej probówki. Przemyć DNA 70% etanolem. Do wysuszenia zostawić na 15-20 minut w 37oC.

UWAGA !!! Nie należy przesuszyć DNA. Będą wtedy problemy z rozpuszczeniem.

11. DNA rozpuścić w 300-400ul Tris-HCl (pH 8.5) - UWAGA !!!! nie używać TE. Pozostawić rozpuszczone DNA na całą noc w temperaturze pokojowej.

12. Tak przygotowane DNA powinno być stabilne przez ok rok.

 

REFERENCJE

  1. Helms, C. Salting out Procedure for Human DNA extraction. In The Donis-Keller Lab - Lab Manual Homepage [online]. 24 April 1990. [cited 19 November 2002; 11:09 EST]. Available from: http://hdklab.wustl.edu/lab_manual/dna/dna2.html.
  2. Epplen, J.E., and T. Lubjuhn. 1999. DNA profiling and DNA fingerprinting. Birhkhauser Verlag, Berlin. p.55.

 

Pobrane z www.protocol-online.org