Izolacja DNA z tkanki

Publicysta
Drukuj

 

Procedura izolacji DNA z tkanki metodą fenolową.

 

BUFORY:

1. Bufor DNA

1M Tris-HCl pH 8.0
20 ml
0.5M EDTA
20 ml
sterylna woda
100 ml

2. Proteinaza K (10mg/ml)

Rozpuścić 100mg proteinazy K w 10ml TE. Mieszać 30 minut w temperaturze pokojowej. Gotowy roztwór przechowywać w -20oC.

3. RNaza A (20mg/ml)

Rozpuścić 200mg RNazy A w 10 ml sterylnej wody. Gotować przez 15 minut, a następnie schłodzić do temperatury pokojowej. Gotowy roztwór przechowywać w -20oC.

 

PROCEDURA:

1. Umieścić 60-80mg tkanki (razem z roztworem w którym tkanka była przechowywana) w naczynku Petri'ego i maksymalnie rozdrobnić.

2. Przenieść całość do 15 ml probówek i odwirować 1500rpm przez 15 minut (4oC).

3. Zlać supernatant. Tkankę przemyć dwukrotnie 1 ml buforem DNA.

4. Usunąć supernatant. Dodać 2.06ml buforu DNA.

5. Dodać 100ul proteinazy K (10mg/ml) oraz 240ul 10% SDS. Dokładnie wymieszać i inkubować przez całą noc w temperaturze 45oC.

6. Jeżeli w dalszym ciągu widoczne są fragmenty tkanki. Dodać kolejną porcję proteinazy K (10mg/ml) i pozostawić w inkubacji (45oC) przez kolejne 5 godzin.

7. Dodać 2.4ml fenolu. Intensywnie mieszać (ręcznie) przez 5-10 minut.

8. Wirować 3000rpm przez 5 minut (10oC).

9. Supernatant przenieść do drugiej probówki. Dodać 1.2ml fenolu oraz 1.2ml mieszaniny chloroform/alkohol izoamylowy (24:1). Mieszać intensywnie (ręcznie) przez 5-10 minut.

10. Wirować 3000rpm przez 5 minut (10oC).

11. Supernatant przenieść do drugiej probówki. Dodać 2.4ml mieszaniny chloroform/alkohol izoamylowy (24:1). Mieszać intensywnie (ręcznie) przez 5-10 minut.

12. Wirować 3000rpm przez 5 minut (10oC).

13. Supernatant przenieść do drugiej probówki. Dodać 25ul 3M octanu sodu (pH 5.2) oraz 5ml etanolu. Mieszać intensywnie aż do precypitacji DNA.

14.Szklaną pipetką pasterowską delikatnie wyciągnąć kłaczki DNA i przenieść do drugiej probówki.

15. Przemyć DNA 70% etanolem. Wysuszyć.

UWAGA!!! Należy uważać żeby nie przesuszyć DNA - może być wtedy problem z jego rozpuszczeniem.

16. Rozpuszczać DNA w sterylnej wodzie (0.5-1ml) mieszając przez całą noc (czasem dłużej).

 

Procedura pobrana z www.protocol-online.org, zmodyfikowana przez autorów.