Minisekwencjonowanie

Publicysta
Drukuj

 

1. PCR

W pierwszym kroku należy namnożyć fragment przeznaczony do sekwencjonowania. Następnie oczyścić produkt z wolnych oligonukleotydów oraz wolnych dNTPs. W tym celu można się posłużyć dwiema metodami:

2. Minisekwencjonowanie

Do tej reakcji polecany jest zestaw firmy Applied Biosystsems (obecnie Life Technologies) SNaPshot Multiplex Kit.

Należy sporządzić mieszaninę:

Warunki reakcji:

25 cykli po:

96oC  przez 10 sek

50oC  przez  5 sek

60oC  przez 30 sek

4oC po reakcji do wyjęcia próbek z termocyklera

Po zakończonej reakcji należy oczyścić mieszaninę z niezwiązanych dideoksynukleotydów. Zalecane jest dodanie 1ul SAP oraz inkubacja 37oC przez 1h, potem 70oC przez 15 min.

Warunki rozdziału:

Czas iniekcji (Injection time):           5-10 sek

Napięcie (Electrophoresis voltage):   15 kV

Czas rozdziału:                               15 min

Temperatura (Heat plate temperature)  60oC

Moduł:                                         GS POP-4 (1ml) E5

Filtr:                                             E5

Powyższa procedura została wypróbowana przez autora niniejszego opracowania jednak nie bierze on odpowiedzialności za jej wykorzystanie.