Wprowadzenie

Administrator
Drukuj

Jeden ze starterów "forward" jest komplemetarny do sekwencji dzikiej genu, natomiast drugi do sekwencji zmutowanej, starter "reverse" jest wspólny. Ważne jest  żeby różnica w sekwencji starterów była na 3' końcu. Oba startery "forward" różnią się długością.

 

Jeśli zachodzi amplifikacja regionu dzikiego genu to w reakcji bierze udział starter "forward" komplementarny do sekwencji dzikiej oraz starter "reverse". Analogicznie jest w przypadku amplifikacji zmutowanego regionu genu. Powstające produkty różnią się długością, ponieważ długością różnią się oba startery "forward".

Analiza elektroforetyczna na żelu agarozowym pozwala nam na wyznaczenie wielkości powstałego produktu, a co za tym idzie na określenie czy w badanej próbce mamy do czynienia z sekwencją dziką czy zmutowaną (ewentualnie mogą występować oba produkty - w przypadku heterozygoty).

Metoda ta jest szybka i stosunkowo mało skomplikowana (pojedynczy PCR oraz rozdział na elektroforezie agarozowej), natomiast samo dopracowanie warunków reakcji wymaga dużej wiedzy i doświadczenia eksperymentatora. Kluczowymi etapami są: zaprojektowanie odpowiednich starterów reakcji oraz precyzyjne dobranie temperatury przyłączania starterów.

Przykładem wykorzystania tej metody jest diagnostyka mutacji 5382insC w genie BRCA1.