Wprowadzenie

Publicysta
Drukuj

 

PCR w czasie rzeczywistym (ang. realtimePCR) jest techniką umożliwiającą podglądanie przebiegu reakcji podczas jej trwania.  Podczas reakcji powstają produkty znakowane barwnikami fluoroscencyjnymi. Detekcja poziomu fluorescencji pozwala na określenie przyrostu stężenia produktów reakcji w poszczególnych cyklach. Dostępnych jest wiele metod znakowania produktów.

Najczęściej stosowanym sposobem detekcji produktów reakcji PCR jest  użyciebarwników interkalujących. Charakteryzują się tym, że tworząc kompleks z DNA nabierają cech fluoroscencyjnych. Wnikają pomiędzy dwa łańcuchy DNA. Przy doborze odpowiedniego barwnika interkalującego należy się kierować dwoma aspektami. Po pierwsze każdy z nich jest inhibitorem reakcji PCR, dlatego należy dobrać taki, którego stosuje się w jak najmniejszym stężeniu. Pierwszym znanym barwnikiem interkalującycm był wykorzystywany do barwienia DNA rozdzielanego w żelach agarozowych bromek etydyny. Niestety charakteryzuje się on niskim stopniem wysycenia łańcucha DNA. Dlatego stosowano go w bardzo wysokim stężeniu. Powyższe cechy uniemożliwiły wykorzystanie bromku etydyny w detekcji produktów reakcji podczas realtimePCR. Obecnie stosuje się takie barwniki jak np.: SybrGreen, EvaGreen itp. Charakteryzują się one prawie 100% stopniem wysycenia DNA. W dodatku daną liczbę kopii cząsteczek DNA zawsze wysycają w z tą samą wydajnością co umożliwia wykorzystanie ich do względnej analizy ilościowej.

Zupełnie odrębnym sposobem detekcji produktów reakcji jest wykorzystanie sond fluoroscencyjnych. Ponieważ powstało wiele technik wykorzystujących sondy o różnej konstrukcji tym tematem zajmiemy się w kolejnych artykułach w dziale realtimePCR.

Obecnie technika realtime PCR wykorzystywana jest do dwóch głównych celów.

Pierwszym z nich jest analiza ilościowa. Analiza dynamiki reakcji w czasie rzeczywistym umożliwia wyznaczenie cyklu (Ct), w którym reakcja wchodzi w fazę logarytmicznego wzrostu. Im więcej matrycy zostało dodanej do mieszaniny reakcyjnej tym reakcja zachodzi gwałtowniej czyli wchodzi w fazę logarytmicznego wzrostu w niższym cyklu. Jeśli wartość Ct próby badanej przyrównamy do wartości Ct kalibratorów (wystandaryzowanych matryc o znanym stężeniu) to jesteśmy w stanie wyznaczyć stężenie matrycy w danej próbie.

Drugą funkcją realtimePCR jest wyznaczanie mutacji/polimorfizmów. Do tego celu wykorzystuje się zarówno barwniki interkalujące jak i sondy. Główną metodą jest wyznaczanie temperatury topnienia produktów reakcji lub wyznaczanie temperatury dysocjacji sondy

RealtimePCR jest w chwili obecnej podstawowym narzędziem w pracy biologa molekularnego.