RealtimePCR z barwnikami interkalującymi z DNA.

Publicysta
Drukuj

 

Najprostszą i najtańszą metodą identyfikacji produktów PCR w czasie rzeczywistym jest użycie brawników interkalujących. Charakteryzują się one tym, że niespecyficznie wiążąc DNA, wzbudzone emitują światło o określonej długości fali. Wzbudzanie polega na oświetleniu próbki światłem w zakresie UV.

Podstawą tej techniki jest reakcja PCR. W pierwszym kroku jej pojedynczego cyklu następuje denaturacja podwójnej nici DNA. Następnie do nici matrycowej przyłączają się komplementarne startery reakcji oraz w miejscu przyłączenia starterów podłącza się polimeraza DNA. W trakcie odbudowywania podwójnej nici barwniki interkalujące wchodzą w przestrzeń pomiędzy dwiema niciami DNA. Na zakończenie etapu wydłużania wzbudzając próbkę światłem o odpowiedniej długości obserwuje się emisję, która jest proporcjonalna do ilości wbudowanego w DNA barwnika. Mierzona wartość fluorescencji jest proporcjonalna do ilości powstałego w danym cyklu produktu.

Należy podkreślić, że w przypadku użycia barwników interkalujących specyficzność powstałych produktów fluorescencyjnych jest determinowana jedynie przez zastosowanie odpowiednich starterów reakcji. Dlatego przy stosowaniu tej metody kluczowym etapem jest moment projektowania starterów oraz optymalizacji warunków reakcji. Wymogiem jest aby w jej wyniku powstawał jeden homogenny produkt z możliwie maksymalną wydajnością. Podstawowym warunkiem podczas projektowania starterów jest unikanie powstawania dimerów oraz bardzo zbliżone temperatury topnienia. Natomiast sama optymalizacja powinna być prowadzona na wstępie przy użyciu zwykłego termocyklera gradientowego z detekcją produktów na żelu agarozowym. Dopiero otrzymanie w obrazie elektroforetycznym pojedynczego pasma o spodziewanej wielkości oraz pozbawionego niespecyficznych szumów niskocząsteczkowych pozwala na dlasze dopracowanie samej reakcji z detekcją w czasie rzeczywistym.

Aby określić wydajność reakcji realtime PCR należy przeprowadzić ją w różnych (znanych) stężeniach matrycy. Po wykreśleniu liniowej zależności logarytmu dziesiętnego stężenia matrycy (oś y) od wartości Ct (cyklu w którym reakcja wchodzi w etap logarytmicznego wzrostu) - oś x, kąt nachylenia otrzymanej prostej opisuje wydajność reakcji.  100% wydajność jest gdy ta wartość wynosi -0.301.

W celu sprawdzenia homogenności otrzymanego produktu należy po przeprowadzonej reakcji PCR określić jego temperaturę topnienia. Wykonuje się to poprzez analizę poziomu fluorescencji w zakresie temperatur 50-98oC. Wraz ze wzrostem temperatury struktura podwójnej helisy ulega rozluźnieniu. Powoduje to stopniowe uwalnianie barwnika interkalującego, co obserwowane jest jako spadek fluorescencji. Krzywa topnienia układa się w charakterystyczny sposób. Wykreślając zależność pierwszej pochodnej sygnału fluorescencji od temperatury można wyznaczyć temperaturę topnienia produktu (maksimum wykresu). Pojedynczy, ostry pik w zakresie temperatur od 80 do 98 oC świadczy występowaniu jednego, homogennego produktu. Obecność innych pików w tym zakresie temperatur pochodzi od powstających niespecyficznych produktów. Występowanie niskich pików w niższych temperaturach mówi nam o powstających dimerach starterów reakcji. W takim wypadku warunki reakcji wymagają dopracowania (np. podniesienie temperatury przyłączania, zmniejszenie stężenia starterów itp) bądź wymiany starterów na inne (szczególnie w przypadku gdy są one bogate w pary G i/lub C).

W związku z relatywnie niskimi kosztami oraz dość łatwą optymalizacją warunków reakcji oddziaływanie z barwnikami interkalującymi jest często wykorzystywane do ilościowej, względnej analizy poziomów ekspresji genów markerowym.