RealTime PCR z sondami hybrydyzacyjnymi

Publicysta
Drukuj

Identyfikacja produktów PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu sond hybrydyzacyjnych zapewnia wysoką specyficzność przy stosunkowo wysokich kosztach prowadzenia reakcji. Typowym przykładem tej techniki jest zastosowanie sond typu TaqMan.

Sondy te zwane są także sondami hydrolizowanymi. Są to oligonukleotydy posiadające na przeciwległych końcach dołączone: barwnik fluoroscencyjny (na końcu 5') oraz wygaszacz (na końcu 3'). W momencie wzbudzenia barwnika przez światło uwalniana energia jest przekazywana na wygaszacz, który ulega wzbudzeniu. Następnie energia z wygaszacza jest uwalniana w postaci ciepła. Tak długo jak fluorofor oraz wygaszacz są w bezpośrednim sąsiedztwie fluorescencja całego układu będzie znikoma. Podczas prowadzenia reakcji PCR, w trakcie anilingu następuje przyłączenie do matrycy starterów reakcji oraz sondy TaqMan. Następnie w procesie elongacji polimeraza DNA "idąc" wzdłuż nici matrycowej dołącza nukleotydy do starterów. Napotykając na swej drodze sondę aktywność egzonukleazowa polimerazy powoduje pocięcie sondy. Dzięki temu procesowi fluorofor oddziela się od wygaszacza, a co za tym idzie wzbudzony emituje światło. Dlatego w procesie elongacji następuje zwiększenie natężenia fluorescencji. Z każdym kolejnym cyklem PCR ilość uwolnionego fluoroforu zwiększa się co powoduje coraz większą fluorescencję. Krzywa obrazująca zależność fluorescencji od cyklu PCR układa się w charakterystyczny kształt dla każdej reakcji enzymatycznej. Punkt wejścia reakcji w fazę liniowego wzrostu (tzw. Ct) jest zależny od stężenia początkowego matrycy. Fakt ten umożliwia analizę ilościową substratów reakcji PCR.

Zastosowanie sond znacznie zwiększa specyficzność reakcji PCR - na specyficzność starterów reakcji "nakłada" się specyficzność sondy. Niestety to rozwiązanie wymaga użycia syntetyzowanych oligonukletodów znakowanych podwójnie (z obu końców) co znacznie podraża eksperyment. Wymaga również znacznie większego doświadczenia od eksperymentatora, ponieważ należy optymalizować warunki temperaturowe reakcji dla trzech oligonukleotydów (dwóch starterów i sondy).

 

Rysunek I. Schemat działania sondy TaqMan.

Rysunek II. Zależność fluorescencji od numeru cyklu w reakcji realtime PCR.